一．目的：

利用ELISA检测样品中目的蛋白的表达量

二．原理：

由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一种既敏感又特异的方法。, U8 [  y$ z8 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：6 U/ R( B8 w. _3 D) s" 
（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；
（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；; G# N. `( I H5 L* L$ a
（3）酶反应的底物。$ j8 ^3 @. X. p6 Y8 n1 m

双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。
其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。 
 若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合，则属于双位点夹心法。
 若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合，则是双抗原夹心法。, _* A3 l, {$ l* x"操作步骤：
 （1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
 （2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
 （3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
 （4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。( R8 ~# I) M  S" 
 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。

三．实验步骤：

1） 溶液配置：

1 包被液（0.1M NaHCO3缓冲液，pH 9.5）：8.4g NaHCO3，3.56g Na2CO3，加水溶解后，定容到1L；

2封闭液(抗体稀释液)： 1X assay buffer；

3 PBS(pH7.0)： NaCl：8 g，Na2HPO4：1.16 g，KH2PO4：0.2g，KCl：0.2g，加水溶解后，定容到1L；

4洗液：PBS+0.05%Tween 20；

5底物液：即用型TMB溶液；

6 终止液（2N H2SO4）：0.5ml 浓硫酸原液，加入8.5ml水，混匀；

7 标准品稀释：

（1） 准备200pg/ml标准品：取1ul 标准品（400ng/ml），加入495ul封闭液，混匀标记为200pg/ml；

（2） 取7只0.5ml EP管，每管中加入150ul 封闭液，依次标记为：200pg/ml，100pg/ml，50pg/ml，25pg/ml，12.5pg/ml，6.25pg/ml，3.1pg/ml；

（3） 准备系列浓度样品：将150ul 200pg/ml标准品加入第1个管中，混匀后，转移到下1管，依次获得不同浓度的样品。

2）操作步骤：

1 采用包被液以250：1的稀释度稀释捕获抗体；

单位（ul）	16孔	24孔	32孔	40孔
捕获抗体	7	10	13	17
包被液	1743	2490	3237	4233

2 每孔加入100ul 稀释的捕获抗体，4度孵育过夜；

3将板中液体倾倒完全后，每孔加入250 ul洗液，洗5次；每次间隔1分钟左右。

4 封闭：每孔加入200ul 1X assay buffer，室温孵育1h；

5将板中液体倾倒完全后，每孔加入250 ul洗液，洗5次；每次间隔1分钟左右。

6 每孔加入100ul 标准品或样品，室温孵育2h；

7将板中液体倾倒完全后，每孔加入250 ul洗液，洗5次；每次间隔1分钟左右。

8 采用封闭液以250：1稀释度稀释检测抗体；

单位（ul）	16孔	24孔	32孔	40孔
检测抗体	7	10	13	17
封闭液	1743	2490	3237	4233

9 每孔加入100ul 上步稀释好抗体，室温孵育1h；

10将板中液体倾倒完全后，每孔加入250 ul洗液，洗5次；每次间隔1分钟左右。

11以封闭液250：1稀释度稀释Sav－HRP(辣根过氧化物酶)，每孔加入100ul，室温孵育30 min；

单位（ul）	16孔	24孔	32孔	40孔
Sav－HRP(辣根过氧化物酶)	7	10	13	17
封闭液	1743	2490	3237	4233

12将板中液体倾倒完全后，每孔加入250 ul洗液，洗7次；每次间隔1到2分钟左右。

13 每孔加入100ul TMB底物液，37度，避光孵育5min；

14 每孔加入50ul 终止液终止反应；

15 30min以内，在酶标仪450nm波长下读板。

四．注意事项

1. 血清的采取

大部分ELISA 检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP 为标记的ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。

2. 加样
加样时应将所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。

3.保温
在建立ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。

4.洗涤
洗涤在ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用。

5. 显色和比色
TMB 经HRP 作用后，约40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 小时后即可完全消退至无色。