一、 实验目的：

通过将重组的质粒转化入受菌内，在诱导剂的存在的情况下诱导融合蛋白的表达，并检测蛋白的表达和可溶性。

二、 实验原理：

受菌的基因组DNA中整合了T7 RNA聚合酶基因，能产生融合蛋白基因转录所需的RNA聚合酶，其转录受lac uv5的调控。将载体质粒转化入受菌内。载体质粒pPAL7含有T7 promoter，其受控于下游的调控元件（乳糖操纵子）lac0。而pPAL7含有lac1，其编码产物是lac1阻遏蛋白，且在受菌中是组成性表达。由于葡萄糖与阻遏蛋白结合后再与lac0结合可以使得T7promoter后的融合基因不表达或者少表达，因此在环境中加入适当的葡萄糖可以使得融合基因在加入诱导剂之后才能够表达，从而起到了控制融合蛋白表达的效果。而且阻遏蛋白还可以与宿主菌染色体上的lacUV5结合从而阻遏T7 RNA聚合酶基因的转录，进而控制融合蛋白的表达。IPTG为异丙基硫代半乳糖，它可以使阻遏蛋白的构象发生改变，使其从lac0和lacUV5上脱落，从而使得T7 RNA聚合酶能顺利的将基因转录，进而使得融合蛋白表达。

将培养液中的蛋白分成可溶与不可溶两种，利用电泳以确定融合蛋白为何种蛋白，从而初步确定纯化方案。

三、 实验试剂：

1) 纯化的重组的质粒

2) E.coli BL21 化学感受态细胞,  SOC回复培养液(可以用LB替代), 含100µg/ml氨苄青霉素和0.5%葡萄糖的LB平板

3) 含100µg/ml氨苄青霉素和0.5%葡萄糖的LB培养液,

4) 0.5 M IPTG

5) 结合/清洗缓冲液

6) 尿素,

7) Laemmli sample buffer

 

四、 试剂配制：

1) LB液体培养基：10 g 蛋白胨，5 g酵母抽提物，10 g NaCl，溶解到1L 水中分装成200 ml/瓶；     

2) 5%葡萄糖：称量5g 葡萄糖，溶解到100 ml水中，采用一次性过滤器过率除菌；

3) 结合/清洗缓冲液（0.1 M PB，pH 7.2）：称取2.8998 g Na2HPO4.12H2O，0.2964 g NaH2PO4.2H2O，加水80 ml溶解，最后定容到100 ml即可；

4) 4N尿素/结合/清洗缓冲液：24 g 尿素溶解到80 ml结合/清洗缓冲液，最后定容到100 ml；

五、 实验步骤:

1) 将纯化的重组质粒转化入E.coli B21中：

l 将感受态细菌从-70°C冰柜中取出,快速吸取5 µl质粒到50 µl感受态细菌中；

l 轻轻旋转以混匀内容物,在冰上放置30 min；

l 42°C热休克30S,冰上放置2 min；

l 每管加入500 µl LB培养基，放入37°C振摇1 h；

l 8000 rpm离心 3 min，去掉培养基，让培养基最后只剩下200 µl，重悬细菌沉淀；

l 将细菌悬液加至含100 µg/ml氨苄青霉素和0.5%葡萄糖的LB平板，37°C培养12-16 h

 

2) 制备过夜培养物：挑取1个菌落至2 ml含100µg/ml氨苄青霉素和0.5%葡萄糖的LB培养液，37°C摇动培养液16-18小时；

 

3) 融合蛋白的诱导表达：

l 取过夜培养物至含氨苄青霉素的LB培养液中，摇动直至细胞密度达到0.5-0.7；

l 加入1-2mM的IPTG，在37°C时摇动4小时，诱导融合蛋白的表达；

l 收集培养物初步检测蛋白的表达水平和蛋白的可溶性。

 

4) 分析细胞培养物以检测蛋白的表达情况及可溶性

l 将2 ml的细胞培养液16000 g ，4°C离心1 min，弃上清；  

l 加入500 µl  bind/wash buffer重悬细胞，在冰上超声处理60s，取50µl处理后的细胞液至一小管标记为“total”；

l 4°C，16000g，离心裂解液5min，取50µl上清至一小管标记为“soluble”

l 加入500 µl含4M尿素的bind/wash buffer重悬不溶的沉淀；

l 16000 g, 4°C,离心5 min，取50µl上清至一小管，标记为“insoluble”；

l 给3支小管中各加入50µl  2X Laemmli sample buffer，95°C加热5min；

l 3支小管溶液各取10µl进行SDS-PAGE电泳；

n 按说明书装好垂直式电泳槽装置；

n 10%聚丙烯酰胺分离胶的配制：

          n 灌注聚丙烯酰胺分离胶： 

n 迅速在模具的两块玻璃板的间隙中倒入凝胶溶液，小心在胶的上面加入纯水，室温条件下聚合30分钟~1小时；

n 聚丙烯酰胺积层胶的配制：

 

 

n 灌注聚丙烯酰胺积层胶：将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，小心避免气泡，完全聚合需15~30分钟；

n 电泳：取出上样梳，立即用水冲洗上样孔，在电泳槽中加入1× 电泳缓冲液，取10 μl~30 μl 样品加入样品池中，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压8V/cm，

n 分离胶电压15V/cm，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止(约需3小时)；

n 染色：将胶从玻璃板中取出，改良考马斯亮兰染色液染色（0.12%考马斯亮兰G250,10%硫酸铵，10%磷酸，20%乙醇），室温1小时以上；

n 采用超纯水脱色至背景较低为止。