一.实验目的：

SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。

二．SDS-PAGE原理

　  SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。当在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，其它因素可以忽略不计。

SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS复合物基本上是相同的，但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。

SDS-PAGE凝胶的有效分离范围

丙烯酰胺浓度（%） 15         12.5           10                  7.5                 5.0

线性分离范围   15-43 kDa   15-60 kDa     18-75 kDa             30-94 kDa            60-212 kDa

三．实验步骤：

1）溶液配置：

1.分离胶缓冲液1.5M Tris-HCL (pH8.8)100ml：

18.17g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH8.8，最后定容至100ml。4℃贮存备用。

2.积层胶缓冲液1M Tris-HCL (pH6.8)100ml：

12.1g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH6.8，最后定容至100ml。4℃贮存备用。

3.10%SDS，100ml：

10gSDS，加入50ml蒸馏水在60℃搅拌溶解，待泡沫消失后，定容至100ml。

4.30%聚丙酰胺贮液（A液）100ml：                  

丙烯酰胺29g，甲叉丙烯酰胺1g，去离子水溶解，定容到100ml。0.45μm滤器过滤除菌，4℃棕色瓶保存。pH≤7.0。

5.考马斯亮蓝染色液 100ml：                 

  考马斯亮蓝R-250 0.25g 甲醇45ml ,冰醋酸 10ml, 蒸馏水45ml

6.考马斯亮蓝脱色液 100ml：               

 甲醇45ml,冰醋酸10ml,蒸馏水45ml

7.SDS电泳缓冲液（25nM Tris 碱，250mM甘氨酸，PH8.3 0.1%SDS）

试剂           MW     所需量    终浓度

Tris 碱       121.1    15.1g    125mM

甘氨酸         75      94g      1.25M

10%SDS                 50ml      0.5%

注意，在加入SDS前应测定PH值

8.10%过硫酸铵：0.1g过硫酸铵溶解于1ml纯水中。

11.2×SDS凝胶上样缓冲液：

试剂                                                         所需量                               终浓度

1Mtris-HCl(PH6.8)                                      1.0ml                                 100mM

Beta-巯基乙醇（或者1M二硫苏糖纯）      1.0ml(2.0ml)                       10%(200mM)

10%SDS                                                      4.0 ml                                4%

甘油                                                          2.0ml                                  20%

溴酚兰                                                        20mg                                  0.2%

分装后，-20℃保存

2）实验操作：

1. 样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5分钟，离心12000×2分钟，取上清做SDS-PAGE分析，同时将分子量蛋白标准样品做平行处理。

2. 按说明书转好垂直式电泳槽装置

要注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。
3．配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。按下表的配制分离胶和浓缩胶。

制备凝胶板：
（1）分离胶制备：按表配制分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。
（2）浓缩胶的制备：按表配制浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。完全聚合需15-30min.待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将1×电泳缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。 
4．加样
 一般加样体积为10－30μL（即2－10μg蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。
5．电泳
 将直流稳压电泳仪开关打开，积层胶电压8×V/cm，分离胶电压15v/cm,先80v30分钟，待样品进入分离较时，在150v2小时。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。
6．染色及脱色
将染色液倒入培养皿中，室温染色4h以上，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，多次脱色直到蛋白带清晰。

7.凝胶摄像和保存

在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或70%乙酸溶液中。

四.注意事项 
1.   不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。

2．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。

3.实验组与对照组所加总蛋白含量要相等

4.为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的ph值要准确，10%过硫酸铵在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。

5.未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。

五．SDS-PAGE trouble-shooting

1) 开始电泳时没有电流：

可能原因：上槽或下槽的电泳缓冲液体积不够。

解决的方法：确信上下槽的电极缓冲液中有足够的缓冲液，同时检查是否漏液。

2）在分离胶中样品进行缓慢：

可能原因：SDS电泳缓冲液配置错误，或是分离胶缓冲液配置错误，或是丙烯酰胺溶液不新鲜造成。

解决方法：重新配置新鲜的缓冲液

3）染料的底部不平（微笑现象）

可能的原因：胶没有冷却均匀或是电流太高

解决方法：1.在电泳过程中，使用循环水冷却胶，同时在下槽缓冲液加一搅拌子，使液体温度均匀。2.下槽缓冲液的体积尽可能大3.限制电流的大小

4)皱眉现象

可能原因：在上样梳的位置胶没有聚合好，装置的安装不合适，或是上槽缓冲液漏液。

解决的方法：1.给凝胶溶液脱气或将过硫酸铵和TEMED的浓度加大一半。2.确定仪器的垫圈没有被压住3.确信有足够量的上槽缓冲液。

5）.染料带形不规则：

可能原因：凝胶的均一性很差，或胶的顶部不平造成。

解决的方法：1.给凝胶溶液脱气或将过硫酸铵和TEMED的浓度加大一半2.在倒完胶后，立刻在胶的表面覆盖上一层溶液把胶的表面压平。