一．构建原理：

慢病毒属于逆转录病毒科, 但其基因组结构复杂, 除gag、po l 和env 这3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外, 还包括4 个辅助基因, vif、vp r、 nef、vpu 和2 个调节基因tat和rev。H IV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒, 第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。慢病毒载体的构建原理就是将H IV 21 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分: 包装成分由H IV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建, 能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白; 载体成分与包装成分互补, 含有包装、逆转录和整合所需的H IV 21 顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV ) 的可能性, 将包装成分的5′ L TR 换成巨细胞病毒(CMV ) 立即早期启动子, 3′ L TR 换成SV 40 po lyA 位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上, 即一个表达gag 和po l、另一个表达env。

二．实验操作举例：

一）磷酸钙法转染HEK293T细胞

1. 试剂配制:

无菌水ddw: 高温灭菌; 分装;

2XHBS: 280mM NaCl

10mM KCl

1.5 mM Na2HPO4

12 mM glucose

50 mM HEPES

Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌,分装;

2M CaCl2: 过滤灭菌,分装.

2. 实验过程:                                                                                

 1. 铺细胞: 选择状态良好的293T细胞传代, 2-3x10⁵个细胞/35mm dish.

2. 20-24h后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染.下面就35mm dish为例,采用以下转染体系:

ddw: 105ul

plasmid: 2 ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)

2M CaCl2: 16.5ul

2XHBS: 125ul

按上述顺序,往eppendorf管中依次加入上述四种试剂.

先将前三者混匀, 最后加2XHBS.

 一种方法是,加2XHBS时要逐滴加入, 吹打至微现乳白色, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.

另一种方法是, 加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定, 建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打), 之后步骤同上, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.

二）转染方法2-Fugene转染

病毒包装1．传293T细胞，将T75用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，置于37度培养箱10min。即可使用，铺细胞前，将明胶再次将瓶底完全覆盖一次，完全吸净，即可将细胞铺上。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/T75；若第三天转染，铺350-400万/T75。每瓶T75加10mL 10％DMEM培养基。

1.1 传293T细胞

将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL 4度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL 37度水浴中预热的10％ DMEM，移液枪用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mL eppendorf管中，加入450ul 10％ DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。

2．转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。

3．做脂转complex：Opti MEM需在37度水浴中预热，Fugene转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。

转染每瓶T75的complex成分如下：

含cDNA的lv质粒：10ug

pVSVG：5ug

 delta 8.91：7.5ug

opti MEM补足至1mL后，用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，加入56ul Fugene转染试剂，加至opti MEM液面之下，吹打3-4次。再用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，室温放置15min，即可加入T75瓶中。晃匀后，隔2-4h后再晃匀一次即可。

4．转染后12-24h，将T75瓶中的培养基弃去，加入10％ DMEM 10mL，即开始收集病毒。

5．收集24-48h 病毒上清，收集后置于4度冰箱保存。

三）感染方法-病毒滴度测定(感染同此法)

5.1 此时即可用病毒上清测病毒滴度（悬浮感染）：

①. 在24孔板中测定病毒滴度，先用明胶包被24孔板10min以上（同步骤1，每孔加入200ul明胶，移液管两滴左右）。

②. 消化293T细胞（步骤1.1），24孔板每孔15万细胞。可将细胞做mix，体积扩大到15万细胞/500ul，加入1/1000 polybrene，混匀，每孔加入500ul 15万细胞即可。

③. 将病毒上清4000rpm离心5min，将细胞碎片离至管底。取5ul病毒上清至上述步骤中传入15万每孔的24孔板一孔中，摇匀；48h后即可在荧光显微镜下观察其滴度。

 5.2 病毒滴度确定：

①. 15万293T细胞48h即可刚好长至90-100％满，此时即可固定细胞，计数确定病毒滴度。

②. 将培养基用真空泵吸去部分，务必不要将其吸净，由于293T细胞易飘，固定及DAPI染色整个过程请务必保持293T细胞处于液面之下。用PBS涮3次。加入4％ PFA室温固定30min, 24孔板每孔200ul。

③．用PBT洗2次，每次3分钟。

④．PBS将DAPI 1000倍稀释，每孔加入200ul，避光室温静置5min。

⑤．PBS洗2次，每次5分钟，即可在荧光显微镜下计数，取2-3处取平均值。

⑥．病毒滴度（IU/mL）=荧光细胞占总细胞数的百分比÷5×1.5×10⁵×10³