一、 免疫组织化学技术的原理和应用范围
（一） 免疫组织化学技术的基本原理
免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。免疫组织化学技术通过抗原抗体反应及呈色反应，对组织和细胞中抗原的准确定位，使其可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中定位观察，并进行形态与功能相结合的研究。
（二）免疫组织化学技术的应用范围
近年来，随着抗原的提纯和抗体标记技术的改进，特别是自70年代中期杂交瘤技术与单克隆抗体技术的引入，使制备的抗体具有高度的特异性。简便而敏感的免疫酶标技术能够用于普通培养细胞（株）、常规福尔马林固定石蜡包埋的组织切片、若干年前的存档标本等，从而使该技术在生物医学研究和临床病理学、微生物学诊断中，日益显示出巨大的实用价值。目前主要应用在如下几个方面：
1 确定细胞类型
通过特定抗体标记出细胞内相应抗原成分，以确定细胞类型。如角蛋白是上皮性标记，前列腺特异性抗原仅见于前列腺上皮，甲状腺球蛋白抗体是甲状腺滤泡型癌的敏感标记，而降钙素抗体是甲状腺髓样癌的特有标记。有些细胞（如表皮内朗格汉斯细胞、黑色素细胞、淋巴结内指突状和树突状网织细胞）光镜下不易辨认，但免疫组化标记（S-100蛋白等）能清楚显示其形态。
2 辨认细胞产物
利用某些细胞产物为抗原制备的抗体，可作为相应产物的特殊标记，如内分泌细胞产生的各种激素，大多数可用免疫组化技术标记出来，据此可对内分泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等。
3 了解分化程度
大多数标记物都有其特定的分布部位，如上皮细胞膜抗原（EMA）着色部位在细胞膜上，但差分化乳癌胞浆内也可出现阳性颗粒；角蛋白的含量也与分化程度有关，低分化或未分化癌含量较低、染色较弱。
4 鉴定病变性质
通过标记Ig轻链（κ、λ）可区分部分B细胞性淋巴瘤与B细胞反应性增生，前者常表达单一的Ig轻链（κ+/λ+），后者常为多克隆Ig轻链（κ+、λ+）。而标记bcl-2蛋白在区别滤泡型淋巴瘤和反应性滤泡增生上有相当的意义。在滤泡型淋巴瘤，90%以上肿瘤性滤泡细胞有bcl-2的高表达；而在滤泡反应性增生时，滤泡反应中心的细胞不表达bcl-2蛋白，而套细胞则表达。
5 发现微小转移灶
某些癌的早期转移有时与淋巴结内窦性组织细胞增生不易区别。用常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的，而采用免疫组化方法（如用上皮性标志）则十分有助于微小（癌）转移灶的发现。对转移性肿瘤也可借助免疫组化标志寻找原发瘤，如骨组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞，提示前列腺癌转移。
6 探讨肿瘤起源或分化表型
一些来源不明的肿瘤长期争论不休，最后通过免疫组化标记取得共识。如颗粒性肌母细胞瘤，曾被认为是肌源性的，但该肿瘤肌源性标记阴性，而神经性标记阳性，证明为神经来源（可能来自神经鞘细胞）。分化差异很大的肿瘤病理上常按细胞形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞肿瘤等，通过多种标记的联合应用，也可能确定其来源。
7 确定肿瘤分期
判断肿瘤是原位还是浸润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关。用常规病理方法判断有时是十分困难的，但用免疫组化法可获得明确结果。如采用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的单克隆抗体可清楚显示基底膜的主要成分，一旦证实上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸润癌了，其预后是不同的。用第八因子相关蛋白、荆豆凝集素等显示血管和淋巴管内皮细胞的标记物则可清楚显示肿瘤对血管或淋巴管的浸润。对许多肿瘤的良恶性鉴别及有无血管或淋巴管浸润，这是主要的鉴别依据，同时也有治疗及预后意义。 8 指导预后和治疗
免疫组化标记中与预后有关的标记大致可分为三类：①类固醇激素受体：如雌激素受体、孕激素受体等，它们与乳腺癌的关系已获公认，性激素受体阳性者内分泌治疗效果较好，预后也较好。相似的结果也见于子宫内膜癌和卵巢癌。②肿瘤基因标记：如癌基因c-erB-2，c-myc，P53蛋白等，在肿瘤中高度表达者，患者预后较差；而nm23蛋白高度表达者，肿瘤转移率较低，预后较好。③细胞增殖性标记：如表皮生长因子受体（EGFR）、增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki-67等，表达指数越高，表明其增殖越活跃，恶性度增高，预后不良，其中以恶性淋巴瘤、乳腺癌较为明显。而且在乳腺癌的研究中发现Ki-67、 PCNA 、EGFR阳性者，淋巴结转移率高，并与激素受体的表达呈负相关。
9 辅助疾病诊断和分类
人体的免疫性疾病，主要是自身免疫性疾病，如肾小球肾炎、皮肤自身免疫性疾病等，可用免疫组化方法对组织细胞内的免疫球蛋白、补体、免疫复合物等进行检测以辅助诊断。某些疾病的分类或分型也是在免疫组化基础上建立的。内分泌肿瘤如垂体前叶腺瘤，根据其分泌功能可分为生长激素腺瘤、泌乳激素腺瘤等10型；胰岛细胞瘤的功能分类为胰岛素瘤、高血糖素瘤等6种；恶性淋巴瘤根据瘤细胞表面标志不同可分为T细胞性、B细胞性。肾小球肾炎的免疫学分类亦需免疫组化或免疫荧光技术。
10 寻找感染病因
人体疾病的致病微生物中有的在常规病理检查中不易发现，尤其是病毒性致病微生物，由于其分子水平的结构，在细胞水平上难以发现，通过免疫组化方法则可明确发现病原体抗原部位以及定量，如巨细胞病毒（CMV）、人乳头状瘤病毒（HPV）、单纯疱疹病毒（HSV）、乙型肝炎病毒（HBV）等，已有商品化标志物帮助解决病因诊断问题。
二、免疫组织化学技术细节处理总论
（一）标本的处理——细节注意
标本的处理是良好免疫细胞组织化学结果的前提，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜，固定及时，形态保存良好，抗原物质的抗原不丢失，不扩散或被破坏。标本的处理过程中应该注意以下两个方面：取材、固定。
1 取材
细胞标本取材可有印片法、穿刺吸取涂片法、体积沉淀涂片法、培养细胞标本取材及离心涂片机法。
1.1 印片法
主要应用于活检组织标本和手术切除标本。新鲜标本以最大面积剖开，充分暴露病变区，将载玻片轻轻压于病变区，脱落细胞便粘附于玻片上，立即浸入细胞固定液内5~10分钟，取出后自然干燥，低温保存备用。
1.2 穿刺吸取涂片法
主要应用于实质器官的病变区，如肝、肾、肺、淋巴结、软组织等。用细胞针穿刺吸取病变区内液体成分，可直接涂抹在玻片上，力求细胞分布均匀。如穿刺液较多，细胞丰富，可用洗涤法，即将穿刺液滴入盛有1~2ml Hank（或RPMI-1640）液的试管内，轻轻搅拌，以500r/min低速离心5~10min后，弃上清液，将沉淀制成细胞悬液（1×106细胞/ml），吸取1滴于载玻片上，轻轻涂抹或用离心涂片机制成涂片，待涂片略干即可固定。 1.3 体积沉淀涂片法
主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多细胞少的标本。体液采取后，必须及时处理，不宜加固定剂。根据标本内细胞数量多少选用不同的处理方法：①细胞数量极多者，可吸取少量液体直接涂在玻片上；②细胞数量少者，可将液体沉淀，然后取沉淀液以1500r/min离心10min，弃上清，将细胞涂片或用离心涂片制成涂片，略干后固定备用。
1.4 培养细胞标本取材
根据培养细胞特性分别采用不同的方法。对某些贴壁生长的细胞，只需将载玻片插入培养瓶内即可制备理想的细胞标本。而对于浮悬培养的细胞，可用离心涂片机制成涂片。
1.5 离心涂片机法
将待涂片的细胞样品成2×105~6/ml的细胞悬液，吸取50～100μl加入涂片机内，1000r/min离心2min后细胞就均匀地分布于玻片上。
制备细胞涂片应注意：①标本反复离心洗涤后，细胞黏附性降低，在免疫染色过程中易脱落，因此，在制片前载玻片上应涂黏附剂；②为节省试剂和便于观察，应将细胞集中在0.6~1cm2的圆圈内，细胞总数以105个为宜；③黏液丰富的标本，如痰液、胃液，未经特殊处理，一般不宜作免疫组织化学染色。
组织标本的取材常受各种因素的影响，应注意：①活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压；②取材部位主要是病变区，但必须取病灶与正常组织交界区；③必要时取远距病灶区的正常组织作对照；④为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即处理或速冻进行冷冻切片，或立即用固定液固定，进行脱水、浸蜡、包埋。如不用迅速制片，也可贮于液氮或-70℃保存。
2 固定
固定在整个免疫组织化学技术中是关键所在。首先，通过固定可使细胞内蛋白质凝固，防止细胞内酶反应过程，防止细胞自溶，保持细胞固有形态和结构；其次，通过固定可以保存组织细胞的抗原性。固定不足，抗原会丢失；固定过度，则抗原性质改变或抗原成分被遮蔽。2.1 固定液的选择
固定液的选择是免疫组化技术成功与否的基础。用于免疫组织化学技术的固定液种类较多，性能各不一样。不同抗原，其稳定性各不相同，对固定液的耐受性差异较大。所以，除要了解不同固定剂的特性外，不同的抗原和标本需经过反复试验，必要时可作多种固定液对比，从而选出理想的固定液。选择最佳固定液的标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构；②最大限度地保存抗原的免疫活性。中性缓冲多聚甲醛（或福尔马林）液是适应性较为广泛的固定液。值得注意的是免疫组织化学技术中禁用含重金属的固定液。
2.2 固定时间因固定液而异
组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
2.3 固定方法的选择
常用的固定方法有两种：浸入法和灌注法。浸入法即将组织浸泡在固定液内（必要时在4℃下），固定时间根据抗原的稳定性以及固定液的性质而定，一般在2-12h之间。灌注法主要适用于动物研究，灌注固定不仅可以使固定液迅速到达全身组织充分固定，而且灌注能冲洗掉红细胞，排除过氧化物酶的干扰。
2.4 固定时应注意
力求保持组织新鲜，勿使其干燥；组织块不宜过大过厚，以体积<2cm×1.5cm×0.3cm为宜，组织块厚度必须控制在0.3cm以内；固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中固定不良而影响效果；组织固定后，应充分水洗，去除固定液，以减少固定液造成的人为假象。
（二）切片方法-细节注意
1 切片方法的选择
光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。
1.1 冰冻切片
是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。冰晶小而多，对组织结构损害大。因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（约1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
冰冻切片一般用恒冷切片机。切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，
进行短暂预固定干燥后贮存于低温。
1.2 石蜡切片
用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃下进行，以尽量减少组织抗原的损失；②组织块大小应＜2cm×1.5cm×0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸蜡；浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以熔点低的软蜡较好。组织块脱水、透明和浸蜡时间可参考下表：
表1 组织块处理时间
除上述两种切片方法外，还有振动切片、塑料切片、超薄切片、碳蜡切片等方法。振动切片主要适用于免疫电镜观察，塑料切片的优点是可以同时作光镜和电镜检测，超薄切片用于电镜标本的制作，碳蜡切片操作简便省时、抗原性保存比石蜡切片好且组织结构清晰，但夏季切片困难。由于后四种切片技术在免疫组织化学技术应用不是很多，所以对其切片的细节注意事项这里不作详细论述。
2 组织切片玻片的处理
2.1 载玻片和盖玻片的清洁
新的玻片上有油污，要用清洁液浸泡12-24小时，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗5遍以上，浸泡在95%-100%乙醇内2小时，用绸布擦干或用红外线烤箱烤干即可。
2.2 载玻片涂黏附剂
为防止因冲洗频繁，致切片脱落，清洗干净的玻片上应均匀地涂一层薄薄的黏附剂。所使用的黏附剂应定期更换成或新鲜配制，以确保合乎要求的黏附度。常用的黏附剂有：树脂胶、铬明矾明胶、多聚赖氨酸、甘油明胶、甲醛明胶、APES等。下面具体介绍三种最常用黏附剂的使用注意事项及其优缺点。
2.2.1 Poly-L-Lysine (多聚左旋赖氨酸) 一般采用分子量30000左右的0.5%多聚赖氨酸最好，也可用试剂公司出售的其浓溶液以1：10去离子水稀释。方法是将玻片浸泡其中，倾尽余液，在60℃温箱中烤干备用，此方法的优点是可以用于多种组织化学、免疫组化及分子学检测中的应用，粘贴效果最好，但价格稍贵。
2.2.2 明胶硫酸铬钾法 将2.5g明胶加热溶于500ml蒸馏水中，完全溶解冷却后加入0.25g硫酸铬钾搅匀充分溶解即可使用。方法是将玻片浸泡其中2 min，取出控尽液体入温箱中烤干备用。此法价格便宜、方法简单，任何实验都可以使用，特别适用于大批量的使用，但应注意，如果液体变蓝或粘稠状停用。
2.2.3 APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷) 此法必须现用现配。将洗净玻片入1:50丙酮稀释的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸馏水中刷去末结合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片应垂直烤片不能平拷，否则组织片中易出现气泡。
三、免疫组织化学技术细节处理各论
（一）免疫荧光细胞组织化学技术-细节注意
1 荧光显微镜标本制作要求
1.1 载玻片 必须光洁，厚度均匀（0.8-1.2mm），无明显自发荧光。
1.2 盖玻片 光洁，厚度在0.17mm左右。
1.3 封固剂 必须无自发荧光，无色透明，常用甘油和0.5mol/L PH9.0-9.5碳酸盐缓冲液的等量混合液作封固剂。
1.4 标本 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部未充分激发。另外，细胞、组织重叠或杂质掩盖影响判断。
1.5 镜油 一般暗视野荧光显微镜和油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可以用缓冲甘油代替。液体石蜡也可用，但折光率较低，对图象质量略有影响。
2 荧光染色注意事项
2.1 染色反应最好在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥，造成非特异性染色。
2.2 染色反应的酸碱度以接近体液环境为宜（PH7.4左右），因此，切片冲洗液及抗体稀释
液均应注意酸碱度的调整。
2.3 组织细胞要求新鲜，因此冰冻切片是免疫荧光染色的首选方法，同时注意避免切片折叠
或杂质过多，以免影响荧光的观察。
2.4 切片经染色后，应及时观察并照相，不宜长期保存，以免褪色。切片在4℃冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30%。
2.5 抗体稀释度以获得最佳染色效果，背景非特异性染色最小为标准，因此对每一批抗体必
须试验摸索，找出最佳稀释浓度。
2.6 为防止抗体效果下降，所购抗体应及早试验，并应尽量减少抗体溶液的冻溶次数。
2.7 若非特异性染色过强时，在染色反应前应先将荧光抗体离心，去除沉淀物后再使用。
3 使用荧光显微镜注意事项
检查时间以每次1-2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本
受紫外线照射15min后，荧光也明显减弱。所以最多不得超过2-3h。
（二）免疫酶细胞组织化学技术
免疫酶细胞组织化学技术与免疫荧光技术相近，所不同的是利用酶标抗体与组织抗原结合后，形成有色沉淀再观察。但与免疫荧光技术相比，该法终产物可在普通光镜下观察，切片能够长久保存，反复观察，适合于镜下半定量分析，DAB终产物具有嗜锇酸性，经锇酸处理后，电子密度增强，可用于电镜观察。技术细节同上述总论中所介绍。 （三）亲合组织化学技术-细节注意
亲合组织化学技术引入免疫细胞化学后使其敏感性进一步提高，更利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的检测。目前已经建立的方法有ABC法、LAB法、BRAB法、SPA-HRP法、凝集素法等。这些方法的共同特点是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的。这里仅介绍最为常用及多见的ABC法。
ABC法即抗生物素-生物素-过氧化物酶法。ABC法是Hsu等于1981年在BRAB法和LAB法的基础上改良的。其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的。ABC法的优点是：敏感性强，特异性强，背景染色淡，方法简单，节约时间，并且由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。 ABC法实验注意事项：
1 内源性生物素活性及其清除
某些组织和细胞内存在着内源性生物素，在应用该染色方法时会与抗生物素结合而产生非特异性染色。因此，对抗生物素结合性较高的组织，如肝、肾、白细胞、脂肪组织、乳腺等，在进行ABC染色前应预先以0.01%的抗生素和0.01%的生物素溶液分别作用20min，以消除其内源性抗生物素结合活性，每次作用后用PBC洗5分钟。必要时，也可用0.3%H2O2-甲醇液孵育以消除内源性过氧化物酶活性。
2 生物素制剂之间相互亲和性差异很大，因此在应用ABC试剂时，应注意厂家批号，对购买
试剂应进行事先预测，以保证实验结果的稳定性。
3 ABC试剂保存以4℃为佳，据报告保存可达两年之久；而在-20℃生物活性在短期内即被破坏。
四、免疫组织化学技术试剂购买及其保存
（一） 免疫组织化学技术试剂正确选择、购买及使用
1 一抗的正确选择与使用
1.1 首选单克隆抗体：单克隆抗体具有高特异性、高亲和力、交叉反应少等特点，避免与细胞或组织蛋白的非特异性结合，减少染色背景。
1.2 多克隆抗体：最好是经样本来源种属正常血清吸附过，尽可能的减少非特异性着色背景。加一抗前，用封闭液（可以是BSA或二抗来源的正常动物血清）充分封闭，以阻断非特异性结合位点。
1.3 正确使用：一般供应商都会提供稀释范围和使用方法。但由于供应商质检所用组织不同，实验条件和操作人为误差，常常需要客户自己再重新选择比例。一般供应商提供稀释比例从1：10稀释度始作倍比稀释。
2 二抗的正确选择与使用
2.1 种属来源要匹配：根据所用一抗选定二抗。一般来说，如果一抗是小鼠源性，二抗应选择兔/山羊或其它种属抗小鼠的抗体。目前，美国Vector公司和Zymed公司都有开发的用小鼠抗体检测小鼠组织的试剂盒，即一抗来源于小鼠，该试剂盒采用了通用非特异性封闭液和专利封闭内源性小鼠Ig的封闭液，可以得到清晰的染色背景。
2.2 注意抗体同种型和亚型：确定一抗同种型和亚型后，可以选择抗一抗来源种属广谱Ig或针对一抗亚型的二抗。如一抗是小鼠IgG1，可以选用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。
2.3 正确使用：也需要重新选择稀释比例。一般供应商提供稀释比例从1：10稀释度始，作5倍比稀释。
3 检测系统的正确选择
检测系统一般有酶法、荧光法和亲和放大系统：亲和素-生物素放大系统很常用，但由于内源性亲和素和生物素广泛存在，经典的SP、SRABC和LSAB法等常出现背景着色，尤其是内源性生物素丰富的肝、肾染色时很难避免。Zymed公司研发的非生物素放大试剂盒NAB和Picture Plus试剂盒，采用多聚氨基酸支架偶联多个抗体和酶、荧光素等信号检测分子起到良好的放大效果，具有高敏、背景清晰等优点。对于啮齿动物组织的免疫化学检测：由于啮齿动物非特异性结合强，最好选用美国Vector公司和Zymed公司都有开发的用小鼠抗体检测小鼠组织的试剂盒。
购买时要求试剂公司提供标准化的试剂，并附详细的试剂说明书，例如抗体的说明书应包括抗体的来源、免疫球蛋白的亚类、单抗或多抗、使用稀释度、使用流程和注意事项、洗涤时缓冲液的适宜离子强度和PH值等。经广泛的文献查阅及与使用者的多次交流，这里特别推荐Sigma公司，Santa Cruz公司，北京中山生物技术有限公司，武汉博士德生物工程有限公司，福州迈新生物技术有限公司。
(二)试剂保存
1 抗体试剂保存
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定，易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防腐剂以延长保存时间。酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3，否则会抑制酶的活性。抗体浓缩液应在-20℃保存，可以长达两年；用时取出，室温融解，如一次或短时间用不完，应进行小量分装，－20℃保存，避免反复冻融；融解后抗体于2－8℃可以保存一个月。稀释的抗体不能长时间保存，在4℃下可存放1-3天，超过7天效价显著降低。用作抗体的稀释液，在夏天温度很高时，最好加入少许防腐剂如叠氮钠、柳硫汞等，以免在切片上作用时间超过10小时而生霉菌。
2 试剂盒保存
完整试剂盒未打开前于2－8℃可以保存一年，打开后，应根据说明书要求对具体试剂进行适当存放。一般标准品应放置－20℃，用不完的抗体试剂应小量分装－20℃保存。
综上，由于免疫组织化学技术的高特异性、高敏感性，集形态、功能、代谢与一体，及其操作简单、试剂来源稳定、价格适中等特点，都使得其广泛地应用于生物医学研究及临床病理诊断中。我们也有理由相信，随着更多新技术的涌入及改善，这门新型的技术将发挥越来越巨大的作用。
四．实验步骤
（一）、试 剂
1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.
2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.
4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液： 用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制
7. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制
8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本
（二）、操作流程
1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟
b 无水乙醇中浸泡五分钟
c 95%乙醇中浸泡五分钟
d 75%乙醇中浸泡五分钟
2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：
A 抗原热修复
a 高压热修复 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复 电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。 c 微波炉加热 在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原： Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.ChromograninA. Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等
B 酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等
1、免疫组化染色SP法
（1） 脱蜡、水化
（2）PBS洗2-3次各5分钟
（3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟
（4）PBS洗2-3次各5分钟
（5）抗原修复
（6）PBS洗2-3次各5分钟
（7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体
（8）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
（9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟
（10）PBS洗3次每次2分钟
（11）滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时
（12）Ⅱ抗中可加入0.05%的 tween-20.
（13）PBS洗3次各5分钟
（14）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度
（15）PBS或自来水冲洗10分钟
（16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化
（17）自来水冲洗10-15分钟
（18）脱水、透明、封片、镜检。
2、SABC法
（1） 脱蜡、水化
（2）PBS洗2次各5分钟
（3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次
（4）抗原修复
（5） PBS洗5分钟
（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体
（7）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
（8）PBS洗3次各2分钟
（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟
（10）PBS洗3次各2分钟
（11）滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟
（12） PBS洗4次各5分钟
（13） DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色
（14）脱水、透明、封片、镜检。
3.三步法（SP系列）：
实验步骤使用说明：
SP9001（兔）适用于兔来源的一抗
SP9002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗
SP9003 （山羊） 适用于山羊来源的一抗
SP9000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗
3.0ml- 价格 ￥230.00 / 6.0ml- 价格 ￥380.00 / 18ml- 价格 ￥1080.00
试剂盒规格及贮存条件
规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)
贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1 年
一﹑试剂盒内容
试剂1 封闭用非免疫的驴血清工作液（含10%驴血清） 即用型
试剂2 生物素化二抗（驴抗兔/鼠/山羊） 即用型
试剂3 链酶卵白素-碱磷酶轭合物 即用型
试剂3 过氧化物酶标记链酶卵白素 即用型
实验步骤简介：
1. 细胞爬片：冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的细胞爬片，置0.1mol PBS 室温10分钟复水。
2. 修复：滴加复合消化液（0.125胰蛋白酶% +0.1胃蛋白酶%+0.01 EDTA% ）（ 0.1molPBS配制）4度30-40分钟 0.1mol PBS 洗三次，每次一分钟
3. 血清封闭：（试剂1）室温 10分钟，倾去。
4. 一抗：37℃ 1小时或4度过夜
5. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟
6. 相应的生物素化二抗（试剂2）37℃ 30-40分钟
7. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟
8. 链酶卵白素-碱磷酶轭合物或过氧化物酶标记链酶卵白素（试剂3） 37℃ 40分钟
9，NBT/BCIP或DAB显色，切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。
名称 ：connexin 43
产品编号 ：CM7269
价格/规格：0.1ml/20ug
技术指标 ：小鼠抗人，大鼠，小鼠 单克隆抗体 Ig分类：IgG2a
适用组织 ：冰冻/石蜡
阳性部位：细胞浆
组织处理：0.1mol枸橼酸缓冲夜-热修复15分钟（95度）
产品说明 ：
产地: Cellscience
四.二步法（无生物素PV6000系列），
实验步骤使用说明：
试剂盒组成
试剂A: 3% H2O2
试剂B: Polymerized HRP-Anti Mouse或Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml（根据一抗宿主而定）
PV6001（兔）适用于兔来源的一抗
PV6002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗
PV6000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗
3.0ml- 价格 ￥300.00 / 6.0ml- 价格 ￥580.00 / 18ml- 价格 ￥1780.00
试剂盒规格及贮存条件
规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)
贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1 年
免疫组化染色步骤
1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3`）。
2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
3. 如果有必要，每张切片加1滴（试剂A）室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3x3`。
4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。
5. PBS冲洗3x5`。除去PBS液，每张切片加1滴或50μl酶二抗聚合物(试剂B)，室温下孵育40分钟或37度孵育30分钟或4度过夜。PBS冲洗3x3`。
6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB或AEC溶液（详见DAB或AEC使用说明书），显微镜下观察3-5分钟（DAB）或10分钟（AEC）。
7. 自来水冲洗，苏木素复染，若有必要，可用0.1%HCl分化，自来水冲洗，PBS返蓝。
8. 如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。封片。
五.SABC法
1、洗载玻片
将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等除去，同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组织吸附，然后置于清水中清洗，除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4（大约冲一个小时左右），再将载玻片浸泡于酒精之中， 然后放到架子上，置于37 oC温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。
2、包埋组织
先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
3、切片
将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5 um，如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40 oC温水中
4、捞组织
当组织载玻片置于40 oC温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37 oC温箱中烘干。
5、脱蜡
依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10 min，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话就要适当延长脱蜡时间，一般为12-15 min
6、抗原修复
脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10 min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3 min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
7、血清封闭
冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5 min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37 oC温箱中半小时。血清稀释10倍（900 ul PBS：100 ul血清封闭液）。
8、加一抗
将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4 oC冰箱中保存过夜。
9、加二抗
将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37oC温箱中半小时。
10、加SABC
将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干组织周围的PBS后加上SABC， 然后置于37oC 温箱中半小时。SABC稀释100倍（990 ul PBS：10 ul SABC）。
11、加显色剂
将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在1 ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀） A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液
12、复染
将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5 min。
13、脱水
将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2 min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
14、封片
用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
六.免疫组化双染实验protocol
第一抗体的染色：
1、 将切片浸在3％H2O2甲醇溶液（新鲜配制）中10分钟，PBS冲洗2分钟×3次
2、 加100ul（2滴）血清封闭溶液（试剂1）到切片上，室温孵育10分钟，倒掉（不能冲洗）
3、 加入一抗（按照说明推荐浓度和孵育条件）
4、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)，冲洗2分钟×3次
5、 加入100ul（2滴）生物素化的二抗（试剂2)，室温孵育10分钟
6、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次
7、 加入100ul（2滴）链霉亲和素-AP（试剂3）的二抗，室温孵育10分钟
8、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次
9、 准备底物溶液：将1滴试剂4A和4B加入到1ml去离子水中，充分混匀；再加入1滴试剂4C，充分混匀
10、 加100ul（2滴）配好的AP底物溶液，室温孵育（镜下检测孵育时间）
11、 使用含有0.05％吐温20的去离子水冲洗终止反应
第二抗体的染色：
12、 加100ul（2滴）双染增强剂（试剂7），孵育
13、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)，冲洗2分钟×3次
14、 加100ul（2滴）血清封闭溶液（试剂1）到切片上，室温孵育10分钟，倒掉（不能冲洗）
15、 加入稀释好的一抗（按照说明推荐浓度和孵育条件）
16、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)，冲洗2分钟×3次
17、 加入100ul（2滴）生物素化的二抗（试剂2)，室温孵育10分钟
18、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次
19、 加入100ul（2滴）链霉亲和素-HRP（试剂5）的二抗，室温孵育10分钟
20、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次
21、 准备底物溶液：将1滴试剂6A和6B加入到1ml去离子水中，充分混匀；再加入1滴试剂6C，充分
混匀：
22、 加100ul（2滴）配好的HRP底物溶液，室温孵育（镜下检测孵育时间）
23、 使用含有0.05％吐温20的去离子水冲洗终止反应
24、 使用复染试剂染色（根据需要选择）
25、 封片剂（试剂8）封片，显微镜观察结果
五．免疫组化常见问题及其解决办法
1、 一抗从4度拿出后，为什么要进行37度复温？
（1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；
（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
（3）其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。
2、切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？
全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：
（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。
（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
3、脱片产生的原因有哪些？
（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。
（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。
（3）没烤好，时间短，温度不够之类。
（4）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。
（5）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。
（6）一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。
（7）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。
4、免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？（尤其是微波修复）
关于抗原修复，我试过的修复条件有EDTA热修复，柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果来看，微波修复其实很不容易掉片子的，而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起，而微波修复水加热到沸腾，沾在片子上的气泡就会少，不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时，你可以将片子靠的尽量近些，或是在载玻片四周垫些棉花什么的，然后盖上盖玻片，这样修复的话就能够尽量减少载玻片上小气泡的形成。我们用的微波修复条件为：2.94 g柠檬酸三钠溶于1000 ml的水，调PH值至6.0，微波修复10分钟。你可以试试，时间可以根据需要自己调整。对于柠檬酸修复来说，只要高压修复时间控制在加阀冒气后90秒，冷水下终止开高压锅盖，高压修复和微波修复一样不掉片子，而且一般高压修复效果往往更好一点；关于EDTA热修复，一般说明书上都讲的是PH值等于9，实际上我试过，如果单传用EDTA，很容易掉片子，但是用Tris-EDTA,一般就不会掉片子了，Tris-base的浓度为0.05 mmol/L,高压和微波修复都可以，PH也等于9。
5、DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？
着色不均匀可能与你的实验手法有很大关系，可能原因有：
（1）切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。
（2）有可能是你 显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。
（3）如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5 cm。
