实验目的
掌握动植物材料石蜡切片的方法及要求。

实验原理
 石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。该法多采用旋转式切片机进行切片。

实验材料
小白鼠各种器官组织

试剂
１、７０％、８０％、９０％、９５％酒精及无水酒精： 
    ９５％以下的各级浓度酒精是用９５％酒精加蒸馏水稀释而成。简单的稀释方法：所需稀释的浓度是多少，就量取多少毫升原浓度的酒精，再加蒸馏水至该酒精的原浓度即可。例如，配制７０％酒精，就量取７０ml９５％酒精，然后加入２５ml蒸馏水即成。 
２、固定液： 
  　常用的固定液有１０％福尔马林、Bouin氏液和Zenker氏液等。Bouin氏液在组织学切片技术方面应用甚广，配方如下： 
    　苦味酸饱和水溶液         ７５ml 
    　福尔马林     　　          ２５ml 
    　冰醋酸 　　                 ５ml 
３、蛋白甘油： 
    蛋白甘油是粘贴蜡片用的粘片剂。配方如下：取一新鲜鸡蛋的蛋白，充分搅拌成雪花状泡沫，然后滤去泡沫，加入等量甘油，搅拌均匀，再加入一小粒麝香草酚防腐。 
４、染色液： 
  　以H.E.染色法为例，需配制苏木精染液和曙红染液。 
⑴、苏木精染液：苏木精是一种碱性染料，它可将染色质染成蓝紫色。配方有多种，现介绍Harris氏苏木精的配制： 
       甲液：    苏木精                     　 　 ０.５ g 
                 ９５％酒精               　　　  ５.０ ml 
       乙液： 硫酸铝钾（或硫酸铝铵）           １０g 
          　     蒸馏水                   　　　       １００ ml 
               　氧化汞                   　　　　    ０.２５g 
            　   冰醋酸                   　　　　     几滴 
 　 先将甲液溶解，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水中，并加热使溶解，然后将两液混合煮沸，离开火焰后缓缓加入氧化汞。冷却后过滤，加入几滴冰醋酸即成。 
⑵、０.５％曙红酒精溶液：即０.５g曙红溶于１００ml９５％酒精中。 曙红是一种酸性染料，它可使多种细胞的细胞质染成粉红色或红色。 
５、盐酸酒精： 
    盐酸酒精用于分色。配制方法是在１００ml７０％酒精中加入１ml盐酸。 
６、其它： 
  　二甲苯、切片石蜡、中性树胶等。

实验方法
• 石蜡切片技术（一）取材与固定
• 石蜡切片技术（二）渗透与包埋
• 石蜡切片技术（三）切片
• 石蜡切片技术（四）染色
• 石蜡切片技术（五）观察总结

一、取材与固定
1 准备工作：工具、药品、计划等
2 动物的麻醉：氯仿麻醉
3 解剖取材
4 材料分割：保持样品的完整性与代表性，考虑切片方向，实心组织大小5*5*2mm,空心细长组织10mm长。
5 固定：布温氏固定液固定24h。
6 漂洗：70%乙醇换洗3次，每次20~60min。
7 保存：70%乙醇0~4 ℃ 。

二、脱水、渗透与包埋
1 脱水：85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇，每步30min~60min
2透明：1/2乙醇＋1/2二甲苯→二甲苯→二甲苯，每步30min~60min
3 渗透： 1/2二甲苯＋ ½石蜡→石蜡→石蜡，每步20min~60min，温度62℃
4 包埋：将材料放入盛有石蜡的纸盒中，摆好位置（要考虑下一步的修快与切片方向），在水中冷却5～10min.

三、切片
1 修块 用单面刀片在玻璃板上修快使达到以下要求：
（1）一个蜡块含一个材料，蜡块呈正方形或长方形，材料位于蜡块正中央。
（2）材料边缘与蜡块边缘平行，各面要平直，材料边缘与蜡块边缘的距离约3mm。
2 固着 将修好块的蜡块用烧热的解剖刀固着在样品台上。
3 切片 按以下顺序进行
（1）将样品台固定在切片机样品臂上，使切面竖直；
（2）调切片厚度5～10um；
（3）将切片刀用纱布蘸少许二甲苯擦净后装到切片机上，调刀角15～20，将刀固定好；
（4）调刀距 使样品与刀口尽可能靠近；
（5）切片顺时针摇动切片机速度40-60r/min；
（6）将切好的蜡带光面向下用毛笔放到台纸上

4 贴片

5 贴标签 临时标签，用铅笔写明组号、姓名。

四、染色
1 脱蜡 二甲苯(2)→二甲苯(1)，每步10-15min；
2 复水 1/2乙醇+1/2二甲苯→100%乙醇(2)→ 100%乙醇(1)→ 85%乙醇→ 70%乙醇→ 50%乙醇→ 30%乙醇→蒸馏水,每步2min；
3 初染 代氏苏木精染色15min；
4 分化 0.1%HCl脱色至变红→0.1%NaOH至变蓝；
5 脱水 蒸馏水（3－5s）→ 30%乙醇→ 50%乙醇→70%乙醇→ 85%乙醇,每步2min；
6 复染 0.5%伊红（溶于95%乙醇）染色10~15min；
7 脱水透明95%乙醇(1020s)→100%乙醇(1) →100%乙醇(2)→ 1/2乙醇+1/2二甲苯→二甲苯(1) →二甲苯(2)(≥3min),每步2~3min；
8 封片 将材料周围擦干净（注意在擦的过程中材料上的二甲苯必须保证不能干，可随时补加），加1～2滴中性树胶，加盖玻片（需提前洗净擦干备用）；
9 贴标签 注明样品名称、染色方法、组号、姓名和日期；
10 镜检 检查样品取材、切片及染色情况，熟悉样品为下次样品观察做好准备；
11 干燥 平放于展片盘中，于37℃温箱中或自然干燥；
12 预习 下次实验：样品的观察，需提前做好预习，并准备纸、铅笔。