细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

 

一、简介

随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。

TH1与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。　早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－g　)

近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。

胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点：

Ø  快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便；

Ø  简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；

Ø  灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；

Ø  高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；

Ø  安全：减少样本处理与生物源性污染

Ø  接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。

二、所需仪器

1.流式上样管及细胞培养皿或板

2.25%CO₂，37℃孵箱

3. 混匀振荡器

4.离心机

5.加样器、Tips

6.流式细胞仪

三、常用的标本类型和处理方法

全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。

组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640培养基中，调节细胞浓度为2×10⁶细胞/ml。

细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2×10⁶细胞/mL于新鲜培养基中。

冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，－70℃冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。

四、所需试剂

1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂

依据实验需要选择特殊表面标志

CD45圈定所有淋巴细胞
CD3 圈定T淋巴细胞
CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群

CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群
CD19/或CD20圈定B淋巴细胞
CD56圈定NK淋巴细胞
CD14圈定单核细胞

2、荧光标记的细胞因子抗体：R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体

3、溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素（R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目录号00-4333）溶解红细胞

4、激活剂

①Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)（Alexis，目录号ALX-445-004-M001）

A.DMSO中调节浓度0.1mg/mL

B－20℃储存。勿反复冻融.分装(20ml)

C.每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液

D.PMA终浓度25ng/mL细胞悬液

②Ionomycin  （Alexis,目录号ALX-450-006-M001）

A.于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL

B.－20℃储存

C.每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液

D.细胞悬液.Ionomycin终浓度1g/mL

③ Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)

A.无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL

B.4℃储存

C.细胞悬液.SEB终浓度10mg/mL

④CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞

⑤CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml

5、阻断剂

阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内

① Brefeldin-A(BFA) （eBioscience，目录号00-4506）

A. 于DMSO中调节浓度5mg/mL
B).-20℃储存。勿反复冻融.分装(20 mL)
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液
D .细胞悬液.激活最后4－5小时BFA终浓度10mg/mL.

注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降

② Monensin （eBioscience，目录号00-4505）

6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640

7、 固定剂：细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目录号00-8222）

8、 破膜剂：含1％皂甙、0.05％叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目录号00-8333）

将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合

9、其它试剂：无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。

五、细胞培养和刺激的基本方法

细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。

表1、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法

检测细胞因子	阳性对照刺激方法
人IFN-g	方法2 (4-24 小时)
人TIMP-1	方法5
a人TNF-	方法7 (6 小时)
人IL-1a	方法3 (6 小时)
b人IL-1	方法3 (24 小时)
人IL-2	方法2 (4-24 小时)
人IL-4	方法4
人IL-5	方法1
人IL-6	单核细胞：方法3 (6-12 小时) T细胞：方法6
人IL-10	方法1
人IL-12	方法8
人IL-15	方法3
人Fractalkine/CX3CL1	方法1
人IL-8/CXCL8	方法3 (24 小时)
人MCP-1/CCL2	方法3 (24 小时)
人MIP-1a/CCL3	方法3 (24 小时)
人MIP-1b/CCL4	方法3 (24 小时)
人RANTES/CCL5	方法1
小鼠IL-2	方法9
小鼠IL-4	方法10
小鼠IL-5	方法10
小鼠IL-6	方法11
g小鼠IFN	方法9 or 方法12
a小鼠TNF-	方法9

为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂 (如3uM monensin，10mg/ml的BFA)

方法1:  只使用转染细胞检测

方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.

方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.

方法4: 人的PBMCs或者纯化的CD4^＋细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10 ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目录号204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时

方法5: CD4⁺ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days

方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1b (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)

方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激

 (10 ng/ml) +g (10 ng/ml，目录号285-IF-100) 刺激2 小时，然后使用IFNg方法8: PBMCs细胞使用重组人IFN LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.

方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中，使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时

方法10: CD4^＋T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体，重组小鼠的IL-2（10 ng/ml，目录号402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目录号404-ML-005）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。

方法11: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时

方法12: 小鼠脾细胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时

六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）

1、收获细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时

2、阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色

①在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/10⁶细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。

②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断

3、细胞表面染色

①加适当的细胞表面染色试剂20L于Falcon管中，加入100L激活后的全血 (细胞浓度维持在2×10⁶/mL) 混匀，室温暗处孵育15分钟；

②加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。）

③离心500g 5分钟，弃上清

4、固定和破膜

①加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清；

②加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书）

③加2~3mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。

5、细胞内染色

①加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。

1% PFA固定后再上机或上机加入PBS500mL

②加2~3mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500mL

七、注意事项

1. 标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

2.刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析

3.选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少荧光设置以下对照：

① 未刺激对照：激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生 的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。

② 激活对照：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。

③同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。

4. Fc受体阻断：使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，在小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience, 目录号14-0161-81），在大鼠可以用纯化的抗大鼠的CD32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。

5.荧光素的选择：检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记；同时检测多种细胞因子时，弱表达的应选用PE或APC，FITC标记最好用于高表达细胞因子如IFN-γ

八、问题与解答

 

问题	原因	解决	注释
无CD69胞内染色	细胞未激活	激活剂制备不当，见激活剂制备储存一节。	PMA+Ionomycin激活4小时后CD3+T淋巴细胞CD69阳性率应>90%
	使用了错误的抗凝剂	应使用肝素钠，不要使用肝素锂，避免使用ACD与EDTA等络合钙的抗凝剂。	淋巴细胞激活需要Ca，络合Ca的抗凝剂会影响激活。
	细胞未通透	在使用通透液前先使用溶血素	溶血素辅助细胞通透
	BFA失活或制备不当	详见BFA制备BFA于-20℃储存	详见BFA制备
胞内染色阳性但很弱	抗细胞因子抗体浓度不对	按R&D推荐量使用荧光抗体	正常的激活T淋巴细胞IL-4表达通常<2%，应使用PE或APC标记
	通透后细胞在胞内染色前未洗	按操作程序通透后洗细胞再胞内染色
背景染色太高	荧光单抗不纯或荧光与抗体结合不牢导致解析出的荧光染料非特异结合	使用R&D 试剂	使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，详见Fc段受体阻断节
	抗体与固定后的胞内抗原亲和力低，需提高抗体浓度。	使用R&D试剂并按推荐剂量
	错误的同型对照，对照Ig浓度过高	按R&D推荐量使用R&D匹配的同型对照试剂
严重的细胞损失	洗涤离心步骤丢失细胞	固定通透的细胞离心500g	固定后细胞密度低于活细胞，需用高转速离心。
	加样步骤丢失细胞	弃上清带走细胞	小心吸样
溶血不完全	PMA+Ionomycin激活	按操作步骤用FL3做阈值去除碎片和未溶细胞	PMA可稳定红细胞膜，PMA+I激活全血较难溶
	溶血未在室温进行	在室温进行溶血

  

Th1/Th2细胞研究方法

尽管目前提出了较多的 Th1/Th2细胞表面标志，但根据淋巴细胞因子谱的异同识别Th1和Th2细胞仍然是目前最有效的手段，特别是细胞内因子标记的流式细胞技术。近来由于细胞因子ELISA试剂盒的不断涌现，为研究Th1/Th2细胞因子谱的变化提供了准确、可靠、快速的测定方法。但研究CD4+淋巴细胞细胞因子谱变化时需要将T淋巴细胞特异克隆。最近发现，在外周血白细胞中，除CD4淋巴细胞外，CD8细胞也存在Th1和Th2样细胞因子谱的变化，甚至酸性粒细胞也具有产生多种细胞因子的能力，如酸性粒细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα、TGF等。因此单纯通过细胞因子谱的变化难以有效识别Th1和Th2细胞。

根据T辅助淋巴细胞(CD4)分泌的细胞因子谱(cytokine profiles)的不同,将CD4细胞分为Th1和Th2亚群。Th1细胞主要分泌γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β),介导细胞免疫应答；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10及IL-13等因子，促进抗体的产生，介导体液免疫反应。在多数免疫反应中，T辅助淋巴细胞并不产生典型的Th1或Th2细胞和相应的细胞因子，而主要是由Th0细胞分泌的混合型的细胞因子。但在疾病的状态下，Th0细胞受特异抗原的刺激时，一方面向Th1方向发展，另一方面可能向Th2方向发展。如在结核感染转状态下可产生Th1和Th2双向免疫反应，在I型超敏反应疾病时主要产生以Th2为主的免疫反应。近几年来研究发现，Th1/Th2平衡失调参与多种疾病过程，如肿瘤免疫、移植免疫及变态反应等，而用流式细胞仪进行Th1/Th2的检测克服了传统方法所得结果为整个群体分泌数值不能区分单个细胞或亚群的反应的不足，通过表面染色多参数分析可以区分表达特定细胞因子的细胞亚群。一般用CD3⁺/CD4⁺  或CD3⁺/CD8^-作表面标记，选择相应的荧光标的抗体，Th1和Th2细胞分泌细胞因子的情况如全血标本经过刺激培养、表面标记、固定、破膜、胞内染色（IQ，Cytodetect™kit(basic)，CAT方法，IQP-367）

正常全血标本用流式细胞仪检测细胞因子的参考值

一批健康志愿者的全血用PMA+Ionomycin刺激5小时后，按照操作程序测得参考值如下：

细胞因子	阳性细胞（均数%）	阳性细胞（范围 %）
IL-2	35.5	25.0-41.5
IL-4	1.6	0.7-2.2
IFN-γ	24.9	18.0-31.7
TNF-α	23.3	13.6-35.9