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分子克隆常规操作

发布者：Primerbank 时间：2017-09-29 浏览量：1295


1. 质粒转化

具体操作步骤：


  • 将1ul 质粒DNA加入1.5ml的离心管；
  • 将感受态细菌（competent cells）从－70℃冰柜中取出，快速吸取50ul感受态细菌，加入含质粒DNA的1.5ml的离心管；
  • 轻轻地旋转以混匀内容物，在冰中放置30～60 min；
  • 42度热休克90s（该时间应该非常准确，用Timer记时），冰上放置5min；
  • 每管加500ul LB培养液，放37℃水浴1h；
  • 吸取200ul培养物至含相应抗生素的90mm LB平板上，涂布棒将培养液涂布均匀；
  • 倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。



2. 质粒的抽提

具体操作步骤：


  • 用前将RNase A管的液体全部加到 SolutionⅠ（加好RNaseA的溶液I一般储存在4℃）；
  • 将60ml的乙醇加到洗涤缓冲液瓶
  • 37℃培养16h的平板中挑取一个单菌落（直径2～3mm），接种到10ml LB培养液37℃剧烈振摇培养16 h；
  • 取4ml菌液到5ml 离心管，8000rpm室温离心3min；
  • 去上清，放于面巾纸上吸干痕液，
  • 加250 ul Solution Ⅰ（注意用前应该加RNase A管），于涡旋振荡器重悬细胞；
  • 加250 ul 37℃预热2-3min的Solution Ⅱ；
  • 加350 ul Solution Ⅲ，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次；
  • 将5ml离心管中的溶液倒入1.5ml 离心管中，
  • 室温孵育2-3min，12000rpm 4℃离心15 min；
  • 装配2ml 收集管（白色）和柱状收集管（蓝色）
  • 将上清倒入柱状收集管（蓝色）中；
  • 8000rpm室温离心3min；
  • 去掉收集管中的液体，加500ul Buffer HB 到柱状收集管中，10000rpm室温离心1min；
  • 去掉柱状收集管中的液体，加750ul Wash Buffer（注意用前加乙醇），10000rpm室温离心1min；
  • 重复上述步骤一次；
  • 不加Wash Buffer将管子10000rpm室温离心1min；
  • 将柱状管放到一个消过毒的1.5ml 离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm室温离心3min 洗提（洗脱）DNA。


3. 质粒电泳

具体操作步骤（以倒20ml的胶为例）：


  • 用50ml量筒量取20ml 1XTAE；
  • 用电子天平称量0.16g琼脂糖，并倒入20ml电泳缓冲液中；
  • 将称量纸覆盖在装有琼脂糖的电泳缓冲液的三角瓶中，放入微波炉中转1min30s，至肉眼看不到颗粒状琼脂为止；
  • 至室温待溶液冷却至60度左右，将三角瓶中溶液倒入制胶盒中，并加入上样梳子；
  • 至室温约30min胶凝固后，拔掉梳子并将凝胶安放到电泳槽内；
  • 向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm；
  • 将样品中加入适量的10X上样缓冲液，该上样缓冲液的体积计算如下：如果样品体积是20ul加入2ul 10X上样缓冲液，如果是30ul，加入3ul 10X上样缓冲液；
  • 将样品加入上样槽中，打开电源，一般为120v，电泳约20-30min，关掉电源，在Dark Reader荧光透射仪观察结果。



4. 质粒回收

具体操作步骤：


  • 先将水浴箱打开调温至50℃；
  • 在电泳的作用下分离DNA片段；
  • 戴防护眼镜用Dark Reader荧光透射仪切割需要的DNA条带，DNA条带暴露于荧光灯的时间<30 s；
  • 加入700ul binding buffer；
  • 于50-55℃水浴箱中孵育5 min，期间在涡旋振荡器上振荡2-3次，使凝胶完全溶化；
  • 将溶化后的DNA/agarose 溶液加到柱状-收集EP管中8000rpm室温离心3min，倒掉液体；
  • 加500ul Bind Buffer，8000rpm室温离心1min，倒掉液体；
  • 加750ul Wash Buffer 液，10000rpm室温离心1min，倒掉液体；
  • 加750ul Wash Buffer 液，8000rpm室温离心1min，倒掉液体；
  • 去掉收集管中的液体，将空柱状EP管8000rpm室温再次离心1min，用电风扇吹1min，以防止柱状管基质中带有残余乙醇
  • 将柱状管放到一个消过毒的1.5ml EP管中，加35ul DNA Elution Buffer，室温放置3min，8000rpm室温离心3min 洗提（洗脱）DNA。
  • 将回收DNA进行电泳观察片段浓度；



5. 连接反应

连接体系一般为：

（1） 载体：1ul

（2） 片段：12ul

（3） 10X 连接Buffer：2ul

（4） T4连接酶：1ul

（5） H2O：5ul

加入的顺序为：（5）-（3）-（1）-（2）-（4）

 

 

1． 293FT细胞传代：细胞培养采用DMEM+10%小牛血清，当细胞密度达80-90%的时候可以进行细胞传代，具体步骤如下：

l 弃培养瓶中培养基，直接加入1滴管胰酶-EDTA，室温孵育1min左右，（时间不要太长，否则细胞会消化过度），加入4滴管完全DMEM中和，轻轻吹打细胞瓶，将细胞从瓶底吹下来；

l 将细胞悬液转入10ml的试管中，800rpm，离心3min；

l 弃上清，加入6ml左右D-Hank`s至试管中，轻轻重悬细胞；

l 800rpm，离心3min；

l 弃上清，加入6ml左右D-Hank`s至试管中，轻轻重悬细胞；

l 800rpm，离心3min；

l 弃上清，加入4ml完全1640重悬细胞后记数；

2． 293FT细胞铺6孔板，具体步骤如下：

l 细胞以2.5X105/孔数目铺入6孔板，每孔体积3ml；

注：如果需要铺6个孔，先在6孔板中每孔各加入2ml完全RPMI1640，然后取1.5X106细胞重悬在6ml完全培养基中，取1ml加入各孔中；

3．细胞培养24小时或更长时间，该培养时间主要取决于细胞密度，当细胞密度达70%的时候就可以进行质粒的转染；

4．转染前1h，加入25 uM氯奎（原液是25mM，因此使用的时候如果是3ml培养基，加3ul氯奎原液）到需要转染的细胞孔中；

5．转染过程：

l 将下列质粒加入330ul Special H2O中，混匀，然后加入46.5 ul 2M Cacl2，混匀；

l 然后逐滴加入375ul 2XHBS，大约在2min内完成；

l 室温静置5min；

l 然后逐滴加入6孔板中；

Materials

The amount

Concentration

Volume

pMD2G(Envelope plasmid)

0.75ug

0.3815

2.0ul

psPAX2(Packaging plasmid)

2.25ug

0.4857

4.6ul

Plu3f6hRab32(Transfer vector)

3ug

0.3934

7.6ul

Plu3f6hRab32Q83L(Transfer vector)

3ug

0.1877

16.0ul

Plu3f6hRab32T37N(Transfer vector)

3ug

0.3958

7.6ul

Special water

150ul

141.7ul

150ul

CaCl2

2M

23.25ul

2xHBS

187.5ul

Total

375ul

 

1. 质粒转化

具体操作步骤：


  • 将1ul 质粒DNA加入1.5ml的离心管；
  • 将感受态细菌（competent cells）从－70℃冰柜中取出，快速吸取50ul感受态细菌，加入含质粒DNA的1.5ml的离心管；
  • 轻轻地旋转以混匀内容物，在冰中放置30～60 min；
  • 42度热休克90s（该时间应该非常准确，用Timer记时），冰上放置5min；
  • 每管加500ul LB培养液，放37℃水浴1h；
  • 吸取200ul培养物至含相应抗生素的90mm LB平板上，涂布棒将培养液涂布均匀；
  • 倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。



2. 质粒的抽提

具体操作步骤：


  • 用前将RNase A管的液体全部加到 SolutionⅠ（加好RNaseA的溶液I一般储存在4℃）；
  • 将60ml的乙醇加到洗涤缓冲液瓶
  • 37℃培养16h的平板中挑取一个单菌落（直径2～3mm），接种到10ml LB培养液37℃剧烈振摇培养16 h；
  • 取4ml菌液到5ml 离心管，8000rpm室温离心3min；
  • 去上清，放于面巾纸上吸干痕液，
  • 加250 ul Solution Ⅰ（注意用前应该加RNase A管），于涡旋振荡器重悬细胞；
  • 加250 ul 37℃预热2-3min的Solution Ⅱ；
  • 加350 ul Solution Ⅲ，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次；
  • 将5ml离心管中的溶液倒入1.5ml 离心管中，
  • 室温孵育2-3min，12000rpm 4℃离心15 min；
  • 装配2ml 收集管（白色）和柱状收集管（蓝色）
  • 将上清倒入柱状收集管（蓝色）中；
  • 8000rpm室温离心3min；
  • 去掉收集管中的液体，加500ul Buffer HB 到柱状收集管中，10000rpm室温离心1min；
  • 去掉柱状收集管中的液体，加750ul Wash Buffer（注意用前加乙醇），10000rpm室温离心1min；
  • 重复上述步骤一次；
  • 不加Wash Buffer将管子10000rpm室温离心1min；
  • 将柱状管放到一个消过毒的1.5ml 离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm室温离心3min 洗提（洗脱）DNA。


3. 质粒电泳

具体操作步骤（以倒20ml的胶为例）：


  • 用50ml量筒量取20ml 1XTAE；
  • 用电子天平称量0.16g琼脂糖，并倒入20ml电泳缓冲液中；
  • 将称量纸覆盖在装有琼脂糖的电泳缓冲液的三角瓶中，放入微波炉中转1min30s，至肉眼看不到颗粒状琼脂为止；
  • 至室温待溶液冷却至60度左右，将三角瓶中溶液倒入制胶盒中，并加入上样梳子；
  • 至室温约30min胶凝固后，拔掉梳子并将凝胶安放到电泳槽内；
  • 向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm；
  • 将样品中加入适量的10X上样缓冲液，该上样缓冲液的体积计算如下：如果样品体积是20ul加入2ul 10X上样缓冲液，如果是30ul，加入3ul 10X上样缓冲液；
  • 将样品加入上样槽中，打开电源，一般为120v，电泳约20-30min，关掉电源，在Dark Reader荧光透射仪观察结果。



4. 质粒回收

具体操作步骤：


  • 先将水浴箱打开调温至50℃；
  • 在电泳的作用下分离DNA片段；
  • 戴防护眼镜用Dark Reader荧光透射仪切割需要的DNA条带，DNA条带暴露于荧光灯的时间<30 s；
  • 加入700ul binding buffer；
  • 于50-55℃水浴箱中孵育5 min，期间在涡旋振荡器上振荡2-3次，使凝胶完全溶化；
  • 将溶化后的DNA/agarose 溶液加到柱状-收集EP管中8000rpm室温离心3min，倒掉液体；
  • 加500ul Bind Buffer，8000rpm室温离心1min，倒掉液体；
  • 加750ul Wash Buffer 液，10000rpm室温离心1min，倒掉液体；
  • 加750ul Wash Buffer 液，8000rpm室温离心1min，倒掉液体；
  • 去掉收集管中的液体，将空柱状EP管8000rpm室温再次离心1min，用电风扇吹1min，以防止柱状管基质中带有残余乙醇
  • 将柱状管放到一个消过毒的1.5ml EP管中，加35ul DNA Elution Buffer，室温放置3min，8000rpm室温离心3min 洗提（洗脱）DNA。
  • 将回收DNA进行电泳观察片段浓度；



5. 连接反应

连接体系一般为：

（1） 载体：1ul

（2） 片段：12ul

（3） 10X 连接Buffer：2ul

（4） T4连接酶：1ul

（5） H2O：5ul

加入的顺序为：（5）-（3）-（1）-（2）-（4）

 

 

1． 293FT细胞传代：细胞培养采用DMEM+10%小牛血清，当细胞密度达80-90%的时候可以进行细胞传代，具体步骤如下：

l 弃培养瓶中培养基，直接加入1滴管胰酶-EDTA，室温孵育1min左右，（时间不要太长，否则细胞会消化过度），加入4滴管完全DMEM中和，轻轻吹打细胞瓶，将细胞从瓶底吹下来；

l 将细胞悬液转入10ml的试管中，800rpm，离心3min；

l 弃上清，加入6ml左右D-Hank`s至试管中，轻轻重悬细胞；

l 800rpm，离心3min；

l 弃上清，加入6ml左右D-Hank`s至试管中，轻轻重悬细胞；

l 800rpm，离心3min；

l 弃上清，加入4ml完全1640重悬细胞后记数；

2． 293FT细胞铺6孔板，具体步骤如下：

l 细胞以2.5X105/孔数目铺入6孔板，每孔体积3ml；

注：如果需要铺6个孔，先在6孔板中每孔各加入2ml完全RPMI1640，然后取1.5X106细胞重悬在6ml完全培养基中，取1ml加入各孔中；

3．细胞培养24小时或更长时间，该培养时间主要取决于细胞密度，当细胞密度达70%的时候就可以进行质粒的转染；

4．转染前1h，加入25 uM氯奎（原液是25mM，因此使用的时候如果是3ml培养基，加3ul氯奎原液）到需要转染的细胞孔中；

5．转染过程：

l 将下列质粒加入330ul Special H2O中，混匀，然后加入46.5 ul 2M Cacl2，混匀；

l 然后逐滴加入375ul 2XHBS，大约在2min内完成；

l 室温静置5min；

l 然后逐滴加入6孔板中；

Materials

The amount

Concentration

Volume

pMD2G(Envelope plasmid)

0.75ug

0.3815

2.0ul

psPAX2(Packaging plasmid)

2.25ug

0.4857

4.6ul

Plu3f6hRab32(Transfer vector)

3ug

0.3934

7.6ul

Plu3f6hRab32Q83L(Transfer vector)

3ug

0.1877

16.0ul

Plu3f6hRab32T37N(Transfer vector)

3ug

0.3958

7.6ul

Special water

150ul

141.7ul

150ul

CaCl2

2M

23.25ul

2xHBS

187.5ul

Total

375ul

 

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